Os espectrofotômetros percorreram um longo caminho desde o primeiro modelo inventado em 1940. Miniaturizados e combinados com outras tecnologias modernas, esses dispositivos agora têm uma ampla gama de pesquisas e aplicações práticas nas áreas alimentícia, médica, industrial e ambiental. Este artigo enfoca as razões para a popularidade desta técnica.

Princípio da Espectrofotometria

A luz consiste em radiação eletromagnética com uma ampla gama de frequências, comprimentos de onda e energias que viajam na mesma velocidade. Isso inclui o espectro visível, bem como a radiação de comprimentos de onda mais longos e mais curtos em ambos os lados da banda; veja a Figura 1.

Figura 1: Os comprimentos de onda e energias do espectro eletromagnético da luz. (Créditos da imagem: Lumenistics, 2012)

A luz é dividida quando atinge um objeto, pois algumas partes dela são absorvidas e o restante é refletido ou transmitido. O tipo de interação depende dos comprimentos de onda da luz e também da composição química do objeto. A distribuição resultante em termos de frequência e comprimentos de onda é chamada de espectro. O espectro de luz que os objetos emitem nos dá informações sobre sua composição. Por exemplo, a Figura 2 mostra os diferentes espectros produzidos por elementos comuns.

Você pode ver esse fenômeno ocorrendo na vida cotidiana. As folhas parecem verdes porque a clorofila absorve a luz azul e vermelha e emite a luz restante feita de comprimentos de onda verdes.

Figura 2: Os diferentes espectros produzidos pelos quatro elementos variam, NASA. (Crédito da imagem: https://hubblesite.org/contents/articles/spectroscopy-reading-the-rainbow)

O que é Espectrofotometria?

A espectrofotometria é definida como a medida quantitativa da intensidade da luz de vários comprimentos de onda no espectro emitido pela matéria.

A medição quantitativa da interação da matéria com comprimentos de onda específicos tem aplicações importantes em muitos campos da ciência, incluindo física, química, astronomia e bioquímica.

Espectroscopia vs. Espectrofotometria

A espectrofotometria pode parecer semelhante à espectroscopia.

No entanto, há uma diferença vital entre espectroscopia e espectrofotometria. A espectroscopia é usada para analisar a matéria com base nos comprimentos de onda produzidos no espectro, enquanto a espectrofotometria analisa a matéria com base na intensidade da luz em cada comprimento de onda envolvido na interação da luz com a matéria (absorbância, refletância, transmitância).

Assim, a espectrofotometria é baseada na espectroscopia e pode ser chamada de aplicação desta última.

As aplicações de espectrofotometria são úteis para medir a absorbância, refletância e transmissão de luz por gases, líquidos e sólidos.

O que mede um espectrofotômetro?

Um espectrofotômetro mede o número de fótons emitidos para estimar a intensidade dos espectros de luz absorvidos e transmitidos por uma amostra. Isso fornece informações sobre a quantidade de um composto na amostra. Por exemplo, a água limpa permitirá a passagem de mais luz do que uma solução colorida com pigmentos, que absorverá mais luz em muitos comprimentos de onda.

A faixa de luz que cada composto irá absorver será diferente. Por exemplo, a Figura 3 mostra que a clorofila a e b absorvem muitos comprimentos de onda, mas a clorofila a absorve mais luz violeta e laranja, enquanto a clorofila b absorve mais comprimentos de onda azul e amarelo.

Figura 3: Os comprimentos de onda específicos que são mais absorvidos pela clorofila aeb e carotenóides diferem, Guidi, et al. 2017. (Créditos da imagem: Clorofila; Intech, DOI: 10.5772/65594)

Como funcionam os espectrofotômetros

Embora o tamanho e o design de um espectrofotômetro possam diferir, cada um deles consiste em algumas partes básicas (veja a Figura 4):

  • Fonte de luz que fornece luz monocromática/branca.
  • Colimador para convergir a luz em um feixe paralelo.
  • Monocromador para dividir a luz monocromática nos comprimentos de onda dos componentes. Estes podem ser prismas que dividem a luz branca nas cores visuais componentes. O monocromador também pode ser uma grade para obter bandas de radiação UV, visual e IR.
  • Seletor de comprimento de onda , que é uma fenda usada para selecionar o comprimento de onda/banda de luz desejado. 
  • Cubetas , ou recipientes, geralmente feitos de vidro ou quartzo para conter a solução da amostra.
  • Fotômetro , que é um detector fotossensível para medir a quantidade/intensidade da luz absorvida e transmitida através da amostra.
  • Seção de exibição de resultados, que pode ser um medidor ou uma tela digital.

Existem dois tipos de espectrofotômetros com base na faixa de luz escolhida para análise:

  • O espectrofotômetro UV-visível , que usa bandas de luz visível (400 – 700 nm) e ultravioleta (185 – 400 nm).
  • O espectrofotômetro IR , que usa luz infravermelha como fonte.

Figura 4. Partes de um espectrofotômetro de feixe simples e feixe duplo, Jena et al. 2015. (Créditos da imagem: https://www.researchgate.net/project/Microstructure-and-Optical-Properties-of-Thin-films-and-Multilayer-Optical-Coatings)

Pontos de preço do espectrofotômetro

Existem dois tipos de espectrofotômetros: feixe simples e feixe duplo. Consulte a Figura 4 para diagramas esquemáticos.

Os espectrofotômetros de feixe duplo comparam a intensidade da luz do espectro de uma amostra a um feixe de referência. As aplicações que exigem estabilidade, velocidade e automação dependem de espectrofotômetros de feixe duplo e são caras. Estes normalmente têm precisão semelhante ou melhor do que os espectrofotômetros de feixe único.

Os espectrofotômetros de feixe único são econômicos em comparação com as variantes de feixe duplo e têm potencial para um melhor desempenho, pois não precisam gastar energia dividindo o feixe. No entanto, esses dispositivos são menos estáveis ​​do que seus equivalentes de feixe duplo. Além disso, exigem mais trabalho, pois os usuários devem fornecer uma referência para padronizar o dispositivo antes de usá-lo.

Leis da Espectrofotometria

Além do comprimento de onda da luz, a absorbância de um espectrofotômetro é influenciada pela quantidade de um composto em uma solução, bem como pelo tamanho da cubeta. Duas leis definem esses dois aspectos: a Lei de Beer e a Lei de Lambert. Essas leis são consideradas os princípios da espectrofotometria.

Figura 5: “Transmitância (ilustrada por Heesung Shim).” (Créditos da imagem: https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Physical_and_Theoretical_Chemistry_Textbook_Maps/Supplemental_Modules_(Physical_and_Theoretical_Chemistry)/Kinetics/02%3A_Reaction_Rates/2.01%3A_
Experimental_Determination_of_Kinetics/2.1.05%3A_Spectrophotometry)

A Lei de Lambert afirma que existe uma relação direta, mas não linear, entre o comprimento do caminho da luz através da cubeta/amostra (l) e a intensidade da luz transmitida, conforme mostrado na Figura 5. Io é a intensidade da luz antes de entrar a amostra, e É a intensidade da luz depois de ter passado pela amostra.
Então transmitância (T) = It / Io

A lei de Beer afirma que a absorbância da luz depende da concentração do soluto (c).

A combinação das duas leis chamada Lei de Beer-Lambert afirma que a absorbância depende da concentração de soluto (c), sua absortividade molar ou coeficiente de absorção (ϵ) e comprimento do caminho da luz (l).

Então, Absorbância (A) = ϵlc

Absorbância e transmitância não possuem unidades de medida espectrofotométricas.

No entanto, o comprimento do caminho da luz (l) é medido em cm, e ϵ é medido em L·mol-1·cm-1.

Normalmente, a largura da cubeta do espectrofotômetro (ou comprimento do caminho da luz) é de 1 cm, e a absortividade molar de um soluto é conhecida, portanto, com base na leitura de absorbância, o dispositivo pode calcular a concentração ou quantidade de soluto (c) na amostra.

Usos e aplicações do espectrofotômetro

A disponibilidade da espectrofotometria em dispositivos pequenos, portáteis e acessíveis está expandindo o uso desta técnica precisa em aplicações científicas e práticas.
A espectrofotometria líquida foi a primeira aplicação da técnica. No entanto, agora também é comum que espectrofotômetros analisem sólidos opacos, incluindo vidro, e vários filmes, como os usados ​​na fabricação de semicondutores. Da mesma forma, espectrofotômetros de gás são usados ​​para analisar poluentes do ar.
A análise espectrofotométrica tem várias funções:

  • Quantificando concentrações de compostos
  • Determinando a estrutura de um composto
  • Encontrar grupos funcionais em produtos químicos
  • Determinando o peso molecular dos compostos
  • Determinando a composição dos materiais

Essas análises espectrofotométricas de compostos orgânicos e inorgânicos têm aplicações no seguinte:

  • Determinar a composição de materiais, pois cada elemento/composto pode ser identificado com base em seu espectro individual
  • Detecção de impurezas em compostos orgânicos, com a ajuda de espectros únicos de cada composto
  • Determinando a taxa de reação com base na formação de compostos
  • Determinação de compostos inorgânicos verificando sua composição
  • Determinação de proteínas, como grupos funcionais
  • Determinando o crescimento de microorganismos por aplicações de biologia molecular

Onde os espectrofotômetros são usados

Diversos ramos da ciência e da indústria fazem uso das aplicações da análise espectrofotométrica, sendo as mais notáveis

  • Ciência gastronômica,
  • pesquisa bioquímica,
  • diagnóstico médico,
  • Ciência forense,
  • análise de água e ar,
  • e aplicações industriais.

Ciência gastronômica

Um dos ramos mais importantes e em rápido crescimento das aplicações de espectrofotometria está na cadeia de suprimentos de alimentos. A técnica é ideal para a determinação dos compostos orgânicos em ingredientes e misturas de alimentos.

Os espectrofotômetros NIR são usados ​​para análise de alimentos, pois essa faixa de luz tem como alvo as ligações orgânicas formadas entre os elementos de um composto. Essas ferramentas são simples de usar e fornecem medições rápidas de vários constituintes simultaneamente. Além disso, como a água possui menor absorbância, a espectrofotometria NIR pode ser utilizada para analisar alimentos e ingredientes com alto teor de água, como o vinho.

Todos os principais stakeholders da cadeia alimentar – agricultores, processadores, distribuidores, varejistas e restaurantes – podem se beneficiar da análise espectrofotométrica.

Os usos da espectrofotometria podem ser encontrados em praticamente todas as categorias de alimentos em todas as etapas da cadeia de suprimentos, conforme discutido abaixo:

  • Os agricultores analisam a maturação dos produtos frescos, o teor de umidade dos grãos, a qualidade do leite e a maciez da carne. A técnica é útil para o controle de qualidade, além de especificar matérias-primas para permitir a rotulagem correta e melhorar a precificação.
  • Os processadores verificam o conteúdo químico e as origens das matérias-primas, como azeitonas para óleo e cacau para chocolates. A espectrofotometria é útil para verificação e seleção de matérias-primas (por exemplo, na fabricação de queijos) ou para controlar a fabricação e ajudar na rotulagem.
  • Os distribuidores analisam a qualidade da farinha ou do grão de café e verificam a composição química e a origem de produtos como o mel. Monitorar a qualidade dos produtos durante o armazenamento e distribuição e ter uma classificação precisa pode aumentar os lucros.
  • Varejistas e restaurantes analisam água, pão, laticínios e a idade das frutas para garantir a qualidade dos alimentos que fornecem aos consumidores, prolongar o tempo de armazenamento e obter melhores preços.
  • Governos e outros agentes de certificação podem analisar todos os alimentos quanto à contaminação microbiana e toxicológica no local e melhorar o controle de qualidade.

Pesquisa em Bioquímica

Os espectrofotômetros UV-vis são usados ​​na estimativa qualitativa e quantitativa de DNA, RNA e proteínas. Esses aplicativos são úteis na identificação de espécies e monitoramento de reações enzimáticas para determinar os produtos formados e estimar as taxas de reações.

Diagnósticos médicos

Existem várias aplicações dos espectrofotômetros na área médica. Eles podem ser usados ​​para diagnosticar doenças e analisar sangue. Ensaios estabeleceram que espectrofotômetros portáteis podem ser usados ​​para diagnósticos não destrutivos, como

  • encontrar distúrbios na circulação sanguínea,
  • prever o resultado de tratamentos de úlceras gastrointestinais,
  • e monitoramento da dinâmica de drogas em tecidos humanos e animais.

As medições espectrofotométricas também são amplamente utilizadas na indústria farmacêutica.

Ciência forense

Ambos os espectrofotômetros UV-vis e IR são usados ​​para rastrear evidências na área forense. A microespectrofotometria é usada para analisar impurezas que estão presentes em materiais como têxteis, cabelos, óleo, etc., que são muito pequenas para serem examinadas mesmo por microscópios. Da mesma forma, as medições espectrofotométricas também podem identificar cosméticos, tintas, medicamentos, pesticidas, fungos, etc. coletados de evidências ou como evidências.

Outra aplicação das medidas espectrofotométricas é estimar a idade das contusões estudando a degradação do sangue.

Análise de Água e Ar

Atualmente, existem várias fontes principais de poluentes da água: produtos químicos e resíduos animais de fazendas, petróleo e plásticos, bem como descargas de esgoto industrial e não tratado. Estes afetam a qualidade da água em rios e águas subterrâneas. Os poluentes atmosféricos provêm da queima da agricultura e de combustíveis fósseis, como petróleo, gás e carvão.

Poluentes ou agregados específicos podem ser facilmente analisados ​​qualitativa e quantitativamente por espectrofotômetros UV-vis para controlar e monitorar a qualidade da água e do ar.

Usos industriais de espectrofotômetros

Existem diversas aplicações das medidas espectrofotométricas nas indústrias.

A espectrofotometria é usada como uma técnica analítica para encontrar falhas na indústria aeroespacial, química, de petróleo e gás analisando as ligas metálicas, como ferro e alumínio. Por exemplo, as ligas de alumínio são usadas em componentes estruturais na indústria aeroespacial, de modo que a espectrofotometria pode detectar falhas e fraquezas nas estruturas. 

A espectrofotometria também é utilizada no controle de qualidade de sistemas de pintura e cimento.
Os espectrofotômetros UV-vis são adequados para aplicações de colorimetria em indústrias que usam pigmentos, como impressão, têxteis ou produção de tinta.

Aumento de analisadores espectrofotométricos

Vários sensores, dispositivos, sondas ou instrumentos usam espectrofotometria para analisar características bioquímicas e físicas de sólidos e líquidos. Há uma ampla e crescente gama de espectrofotômetros no mercado hoje. Por exemplo, o SpectraVue Leaf Spectrometer CI-710s é um espectrofotômetro NIR usado para estudar muitos processos fisiológicos e detectar estresse em plantas e cuja nova aplicação é a quantificação não destrutiva de concentrações químicas e análise de cores em plantas.

Assim, a aplicação da espectrofotometria continua a se desenvolver rapidamente em muitas novas esferas.

Créditos:
Vijayalaxmi Kinhal
Science Writer, CID Bio-Science
Ph.D. Ecologia e Ciências Ambientais, B.Sc Agricultura
Imagem do recurso cortesia de Neal Fowler .

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