Qual é o microscópio de pesquisa certo para mim? Este artigo fornece uma breve visão geral dos principais recursos que você deve ter em mente ao escolher um microscópio óptico de pesquisa.
Um microscópio óptico é frequentemente um dos dispositivos centrais em um laboratório de pesquisa em ciências da vida. Ele pode ser usado para várias aplicações que esclarecem muitas questões científicas. Assim, a configuração e os recursos do microscópio são cruciais para a cobertura de sua aplicação, variando de campo claro a microscopia de fluorescência e imagens de células vivas.
Este artigo fornece uma breve visão geral dos recursos relevantes do microscópio e encerra as principais questões que devem ser consideradas ao selecionar um microscópio de pesquisa.
Que tipo de espécime você usa?
Uma das primeiras coisas a considerar ao selecionar um microscópio de pesquisa é o tipo de espécime que você deseja explorar. Para amostras fixas montadas em uma lâmina de vidro fina, você pode usar um microscópio vertical. As células vivas exigem características especiais do microscópio porque são mantidas em recipientes de cultura de células relativamente grandes cheios de meios de cultura de células.
Apenas uma configuração invertida, com a objetiva abaixo e o condensador acima da amostra, facilita o espaço livre essencial e a proximidade necessária da objetiva com a amostra. Ao mesmo tempo, um microscópio invertido mantém uma boa acessibilidade às células, por exemplo, para adicionar micromanipuladores.
Além disso, as células vivas requerem um ambiente adequado para sobreviver. A temperatura e a concentração de CO 2 devem ser mantidas em determinados níveis. Uma câmara climática com os controladores correspondentes é necessária para cumprir esta tarefa.
Figura 1: Esquerda: Um microscópio vertical apresenta a objetiva acima e o condensador abaixo da amostra. Direita: Em um microscópio invertido, essa configuração é invertida, dando aos usuários mais espaço, além da proximidade necessária da objetiva com a amostra.
Em que dimensões você pensa?
Espécime microscópico distribuído em três dimensões: comprimento, largura e altura. Enquanto alguns espécimes, como cortes histológicos, são fotografados apenas na direção xy, existem outras aplicações que exigem aquisição também na dimensão z. Para obter imagens de volumes 3D, por exemplo, de células vivas, é recomendado um revólver objetivo motorizado, capaz de guiar sua amostra passo a passo através do foco. O software de imagem deve ser capaz de reconstruir as imagens individuais para visualização 3D.
Para células vivas, você deve adicionar a dimensão tempo. Neste caso, por exemplo, a estabilidade do sistema é outra característica crítica. Devido ao fato de que as mudanças de temperatura influenciam o sistema de imagem durante a aquisição, medidas efetivas de contador são essenciais. Um ajuste de foco automático, como o Adaptive Focus Control ( AFC ) , neutraliza essas influências térmicas e sempre encontra o foco predefinido.
Figura 2: O Controle de Foco Adaptativo ( AFC ) estabiliza automaticamente o foco do microscópio também durante a aquisição de lapso de tempo de longo prazo. Um sensor detecta movimentos de um feixe de luz LED (850 nm) que ocorrem se o vidro de cobertura que transporta a amostra mudar de posição, por exemplo, devido à atividade térmica.
Qual método de contraste se adapta melhor à sua amostra?
A maioria das células – especialmente células animais – investigadas com um microscópio não tem contraste intrínseco suficiente para ver detalhes finos. Os pesquisadores usam métodos de contraste para corrigir esse problema. Enquanto o contraste de fase (PH) e o contraste de interferência diferencial ( DIC ) manipulam a luz que passa pela amostra para adicionar contraste, você também pode corá-la com corantes fluorescentes ( imunofluorescência ), respectivamente, usando proteínas fluorescentes .
De acordo com o método de contraste o microscópio necessita de equipamentos específicos; por exemplo, o contraste de fase precisa de objetivos especiais, enquanto o DIC utiliza certos prismas que precisam ser comutados no caminho da luz. Para microscopia de fluorescência , você precisa de cubos de filtro especiais , permitindo que os comprimentos de onda de luz corretos acessem e saiam da amostra.
Figura 3: Série de células neuronais adquiridas com diferentes métodos de contraste. Da esquerda para a direita: Campo claro, DIC , Contraste de fase, Fluorescência
E a fonte de luz?
A escolha do método de contraste também determina a fonte de luz. A iluminação de luz transmitida para microscopia de campo claro convencional, contraste de fase e DIC pode ser realizada com iluminação halógena ou LED . A microscopia de fluorescência pode ser realizada com iluminação LED ou com a ajuda de lâmpadas de mercúrio , xenônio ou iodetos metálicos de mercúrio .
Quer documentar ou publicar seus resultados?
Se você quiser tirar uma imagem do seu espécime ou fazer imagens de células vivas, você precisa de uma câmera de microscópio digital . Especialmente no caso de imagens de células vivas de fluorescência, uma câmera sensível é recomendada para minimizar a quantidade de luz de excitação que pode prejudicar as células. Além das já consagradas câmeras CCD e EMDDC , hoje em dia as câmeras sCMOS surgiram devido à sua alta eficiência quântica e velocidade de aquisição. Para obter mais informações sobre câmeras de microscópio digital, leia o artigo Introdução à tecnologia de câmera digital.
Além disso, um grande campo de visão (FOV) ajuda a encontrar áreas interessantes mais rapidamente e a criar imagens de mais células ao mesmo tempo. Os microscópios de pesquisa modernos apresentam um FOV de 19 mm na porta da câmera que combina perfeitamente com um chip de câmera sCMOS de 19 mm.
Você precisa de informações (3D) de amostras grossas?
Amostras espessas são um desafio para a microscopia. Especialmente em microscopia de campo amplo , onde toda a amostra é iluminada ao mesmo tempo, identificar os recursos de uma amostra que estão em foco pode ser reduzido drasticamente por luz adicional proveniente de regiões fora de foco.
A Limpeza Computacional pode ajudar a obter imagens livres de luz desfocada. Essa técnica pode ser aplicada em um único plano de imagem para resultados instantâneos (ICC: Instant Computational Clearing) ou pode ser combinada com uma etapa de deconvolução adicional (SVCC: Small Volume Computational Clearing; LVCC: Large Volume Computational Clearing) para resultados ainda melhores . A deconvolução reatribui a informação do fóton à sua origem e, assim, fornece um melhor contraste das estruturas desejadas no plano focal. Isso pode permitir que os usuários distingam estruturas de interesse do plano de fundo mais facilmente do que com imagens tradicionais de campo amplo.
Figura 4: RNA- FISH de molécula única em tecido canceroso. RNA-01 (verde), RNA-02 (magenta) Esquerda: Dados brutos. Médio: Com Compensação Computacional Instantânea. Direita: Após a compensação computacional de grande volume. Cortesia do Prof. Andreas Moor, Universidade de Zurique (Suíça).
Você quer manipular suas células no microscópio?
Durante os últimos anos, a fotomanipulação do espécime tornou-se popular. Isso significa que os pesquisadores não apenas observam as células vivas, mas as manipulam com a ajuda da luz. Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento ( FRAP ) é um exemplo que ajuda a desvendar processos celulares dinâmicos. Para esses tipos de técnicas de manipulação, muitas vezes são necessárias fontes de luz adicionais que devem ser integradas no caminho da luz do microscópio.
Essa abordagem não é trivial, fontes de luz adicionais no caminho de luz do microscópio sem perturbar a qualidade da imagem para fazer, por exemplo , FRAP , foto-comutação, ablação ou optogenética. Com o adaptador certo à mão, os pesquisadores podem até acoplar seus dispositivos construídos em casa.
Qual é o seu orçamento?
Uma questão importante é quanto dinheiro você pode gastar. Alguns fornecedores de microscópios oferecem configurações predefinidas que são adequadas para aplicações especiais. Mas e se você não precisar de todos os componentes pré-configurados pelos quais paga? É por isso que uma configuração gratuita de componentes pode ser mais barata do que comprar um sistema de microscópio predefinido.
Além disso, os requisitos para um microscópio podem mudar com o tempo. Neste caso, um sistema atualizável tem certas vantagens. Com uma configuração predefinida e fixa, você pode ficar preso a uma quantidade limitada de aplicativos. A capacidade de atualização dá a você a liberdade de crescer com as demandas em constante mudança.
Quem vai usar o microscópio?
A gama de usuários de microscópios pode ser muito heterogênea. Especialmente na universidade, os usuários podem ser muito experientes ou iniciantes absolutos. Assim, um sistema de microscópio fácil de usar executado por um software intuitivo, ajuda a iniciar rapidamente as pessoas e a adquirir dados rapidamente. Por exemplo, um design orientado para o fluxo de trabalho, assistentes de análise de imagem e uma integração perfeita de periféricos no sistema simplificam seu trabalho.
Além dos microscópios de pesquisa de campo amplo, os microscópios estéreo também são frequentemente usados em laboratórios de pesquisa de ciências da vida. Por favor, encontre mais informações no artigo " Fatores a considerar ao selecionar um microscópio estéreo ".
